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法庭科学硅藻髓验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法

作者:毕思特科技 来源:毕思特科技 浏览数:115 发布时间:2020/10/23 16:39:18

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法庭科学硅藻髓验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法

法医鉴定硅藻检验的目的:水中尸体的调查在法医学检案中占了重要的一部分.水中尸体未必就意味着其死亡原因是溺死,也可以由其他原因引起,例如死后入水.实际上,尸体现象很难证明死亡的原因.所以,关于受害者是否为“真的”溺死的问题常常不容易解决.目前,硅藻检验被认为是溺死诊断的“金标准”.通过硅藻的定性定量分析,不仅可以对死亡原因有更直接的判断,也可以指向可能的溺死地点.

1范围

本标准规定了法医学硅藻检验的微波消解-真空抽滤-显微镜法。

本标准适用于法医学尸体器官组织及水样中硅藻的定性定量检验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682—2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 26814—2011微波消解装置

GA/T 147—1996 法医学尸体解剖

GA/T 148—1996法医病理学检材的提取、固定、包装及送检方法

JJG 550—1988扫描电子显微镜试行检定规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

硅藻 diatom

一种水生单细胞植物,大小一般为1 jzm〜500 *m。

4方法原理

本方法利用硅藻细胞壁硅质具有耐强酸的特性,釆用微波消解去除有机质,真空抽滤富集硅藻,光 学显微镜(以下简称光镜)或扫描电子显微镜(以下简称扫描电镜)分析硅藻种类和含量。

5实验室条件

5.1检材提取室(或解剖室)

5.1.1设备

5.1.1.1基本设备

符合GA/T 147—1996中附录A的要求。

5.1.1.2自来水过滤装置

自来水出口应加装滤膜孔径小于1 jxm的过滤装置。

5.1.2实验耗材

5.1.2.1器械

符合GA/T 147—1996中附录B的要求。

5.1.2.2器皿

器皿包括:

a)塑料试管;

b)塑料瓶;

c)塑料盒。

5.1.2.3其他耗材

其他耗材包括

a)醋酸纟

b)载玻丿

c)胶带;

d)塑料

5.1.3试剂

甲醛(分

5.2硅藻检

通风橱应以

5.2.1.2自来水过滤

见 5.1.1.2。

5.2.1.3微波消解仪

符合GB/T 26814- 2011的要求

5.2.1.4真空抽滤装置

与消解液接触的部件用耐酸材料制造,满足多通道抽滤,各通道间压力均匀,可调压力范围为 -60 kPa〜一10 kPa;滤杯安装拆卸方便,抽滤区域直径为14 mm〜20 mm。

5.2.1.5显微镜

5.2.1.5.1光镜

配40倍和100倍物镜。

5.2.1.5.2扫描电镜

配真空镀膜设备,符合JJG 550—1988第2章规定的要求,且能在不同放大倍数条件下将样品抽滤 区域分为若干个视场,通过手动或自动方式拍摄每个视场图像。

5.2.1.6电热板

可调节温度,最高加热温度不小于100 °C。

5.2.2量器具

量器具包括:

a)分析天平:感量0.01 g;

b)量筒;

c)移液器。

5.2.3 实验耗材

5.2.3.1器械

器械包括:

a)手术剪;

b)镶子;

c)手术刀;

d)骨锯;

e)骨刮匙。

5.2.3.2器皿

器皿包括:

a)塑料试管;

b)塑料瓶;

c)塑料盒;

d)塑料杯。

5.2.3.3其他耗材

其他耗材包括:

a)塑料吸管;

b)塑料袋;

c)醋酸纤维滤膜:孔径0.45

d)醋酸纤维膜滤杯:装有孔径0.45呻的醋酸纤维滤膜的滤杯;

e)尼龙滤膜:孔径0.45

f)尼龙膜滤杯:装有孔径0.45 Mm的尼龙滤膜的滤杯;

g)载玻片与盖玻片;

h)胶带

i)扫描电镜样品座;

j)碳导电胶带。

5.2.4纯水和试剂

5.2.4.1纯水

不低于GB/T 6682—2008规定的二级水。

5.2.4.2试剂

试剂包括:

a)硝酸(分析纯);

b)30%过氧化氢溶液(分析纯);

c)氢氟酸(分析纯);

d)无水乙醇(分析纯);

e)乙酸-丁香酚混合试剂:乙酸(分析纯)和丁香酚(分析纯)按体积比7 : 3混合的溶液;

f)2 mol/L氢氧化钠溶液:用氢氧化钠(分析纯)和纯水配制。

6检材提取和保存

6.1注意事项

注意事项包括:

a)检材提取室应定期制备控制样品,控制样品制备方法和要求见附录A;

b)控制样品制备、检材提取所使用5.1.2中的实验耗材均为一次性使用,避免交叉污染;

c)解剖前,使用经5.1.1.2自来水过滤装置过滤后的水冲洗尸体表面。

6.2器官组织的提取和保存

6.2.1胸、腹腔未开放尸体器官组织的提取和保存

6.2.1.1提取部位和顺序

依次提取肝、肾、肺,必要时,再提取股骨等其他器官组织。

6.2.1.2提取方法

各器官组织的提取方法如下:

a)肝脏:提取含有包膜的肝脏组织约10。g;

b)肾脏:提取一侧肾脏,尽量保持包膜完整;

c)肺脏:提取肺脏边缘组织约100 g;

d)骨骼:提取股骨1根,如股骨缺则提取胫骨,如胫骨缺则提取肱骨;

e)其他器官组织:按GA/T 148—1996规定的方法提取其他器官组织。

6.2.1.3器官组织的保存

提取的器官组织分别装入合适的容器中,不加任何防腐剂,不能立即送检的应冷冻保存。

6.2.2胸、腹腔开放尸体器官组织的提取和保存

6.2.2.1提取部位和方法

按6.2.1.2d)提取骨骼检材。

6.2.2.2器官组织的保存

见 6.2.1.3。

6.3水样的提取和保存

6.3.1提取位置

提取以下位置水样:

a)已知尸体入水点的,应提取入水点处及发现尸体处水样;

b)未知尸体入水点的,应提取发现尸体处水样,如存在疑似入水点,还应提取疑似入水点处水样。

6.3.2提取方法

按下述两种方法分别提取水样:

a)方法一:直接采取采样点水样500 mL,水深不足1 m的,取底部水样,水深超过1 m的,取水 面下1 m以下水样,用塑料瓶装;

b)方法二:用5.1.2.3f)中的毛刷刷洗采样点岸堤(或水中石头、水草等),取混浊液500 mL,用塑 料瓶装。

6.3.3水样的保存

每500 mL水样加5.1.3中的甲醛25 mL,密封后室温保存。

7硅藻检验

7.1注意事项

注意事项包括:

a)硅藻检验室应定期制备控制样品,控制样品制备方法和要求见附录A;

b)除消解罐外,检验过程中所使用的5.2.3中的实验耗材均一次性使用,避免交叉污染,微波消 解罐的清洗见附录B。

7.2检材取样

7.2.1器官组织的取样

7.2.1.1肝脏的取样

取样方法为:

a)切除肝脏表面组织;

b)换手术刀,切取约10 g深部组织,参见附录C中每个消解罐中肝组织量,将其均分为若干份, 分别置于塑料试管中。

7.2.1.2肾脏的取样

取样方法为:

a)沿肾外缘纵向切开包膜,剥离;

b)换手术刀,切取约10 g深部组织,参见附录C中每个消解罐中肾组织量,将其均分为若干份, 分别置于塑料试管中。

7.2.1.3肺脏的取样

取样方法为:

a)切除肺表面组织;

b)换手术刀,切取约2 g组织,参见附录C中每个消解罐中肺组织量,将其均分为若干份,分别置 于塑料试管中。

7.2.1.4骨髓的取样

取样方法为:

a)刮净骨骼上的软组织和骨膜;

b)用纯水冲洗骨骼3次;

c)锯开骨干,用手术刀去除与锯片接触的骨髓组织;

d)用刮匙刮取全部骨髓组织,置塑料盒(或塑料袋、塑料试管)中;

e)取约10 g骨髓组织,参见附录C中每个消解罐中骨髓组织量,将其均分为若干份,分别置于塑 料试管中;

f)剩余组织置于原包装物中冷冻保存。

7.2.1.5其他器官组织的取样

取样方法参照7.2.1.1进行。

7.2.2水样的取样

将水样摇匀,取10 mL〜100 mL水样置于塑料试管中。

7.3消解

7.3.1器官组织的消解

釆用微波消解,微波消解条件参见附录C。

7.3.2水样的消解

按水样与硝酸体积比5 : 1的比例加入5.2.4.2a)中的硝酸后置于5.2.1.6中的电热板上在80 °C〜 90 'C条件下加热30 min。

7.4真空抽滤

7.4.1光镜检验滤膜样品的制备

制备方法如下:

a)按消解液与纯水体积比1 = 5的比例加纯水至消解罐,稀释消解液;

b)将稀释后同一检材的消解液合并倒入5.2.3.3d)中的同一醋酸纤维膜滤杯中抽滤;

c)加50 mL纯水继续抽滤,使滤膜表面接近中性;

d)取岀滤膜,在5.2.1.6中的电热板上烘干。

7.4.2扫描电镜检验滤膜样品的制备

制备方法如下:

a)按消解液与纯水体积比1 : 5的比例加纯水至消解罐,稀释消解液;

b)将稀释后同一检材的消解液合并倒入5.2.3.3D中的同一尼龙膜滤杯中抽滤;

c)加50 mL纯水继续抽滤,使滤膜表面接近中性;

d)加5.2.4.2d)中的无水乙醇10 mL继续抽滤,去除滤膜内水分;

e)取出滤膜,在5.2.1.6中的电热板上烘干。

7.5硅藻检验 7.5.1硅藻光镜检验 7.5.1.1滤膜透明化处理

处理方法如下:

取载玻片,在中瘀W加

b)将滤膜置于

%)中的乙酸-丁香

7.5.1.2

7.5.2硅藻扫描电镜橙 7.5.2.1滤膜导电处理

用5.2.3.3h)中的碳导电胶4的讎膜粘于5.2.3.如)中的扫描电聲样品座表面,在真空镀膜设备中镀 金属膜,控制膜厚为10 nm〜30 nm。

7.5.2.2扫描电镜检验

采用5.2.1.5.2中的扫描电镜观察经7.5.2.1处理后的滤膜,方法如下:

a)参数设置参见附录D,在合适放大倍数下将滤膜抽滤区域划分为多个视场,并以手动或自动方 式拍摄每个视场图像;

b)观察所拍摄视场图像,如发现疑似硅藻的颗粒,调节样品位置至相应视场,在更高放大倍数下 观察颗粒微观形貌并拍摄图像,根据颗粒的形状和表面纹理结构判断其是否为硅藻及属何种 硅藻;

c)记录硅藻种类和数量,并按式(1)计算器官组织和水样中的硅藻含量。

8结果评价

8.1结果有效性

只有在排除实验室污染后,检验结果才有效。

8.2结果表述

如检材未检出硅藻,则检验结果表述为:检材中未检出硅藻。

如检材中检出硅藻,则检验结果应表明检材中检出的硅藻种类和含量。

A.1控制样品的制备

A.1.1检材提取室(或解剖室)控制样品

A.1.1.1实验耗材和试剂监测祥矗的制备

A.1.1.2空气监测样銘的制

A.1.2.4消解罐监测样品的制备

将按附录B清洗干净的消解罐用纯水冲洗2次,收集第二次的冲洗液于塑料瓶中,室温下保存。

A.2控制样品的检验

A.2.1检材提取室(或解剖室)控制样品的检验

A.2.1.1实验耗材和试剂监测样品的检验

A.2.1.1.1光镜检验

检验方法如下:

a)将经A.l.1.1制备的样品倒入5.2.3.3d)中的醋酸纤维膜滤杯中抽滤;

b)加50 mL纯水继续抽滤,使滤膜表面接近中性;

c)取出滤膜,在5.2.1.6中的电热板上烘干;

d)按7.5.1进行硅藻检验。

A.2.1.1.2扫描电镜检验

检验方法如下:

a)将经A.1.1.1制备的样品倒入5.2.3.3D中的尼龙膜滤杯中抽滤;

b)加50 mL纯水继续抽滤,使滤膜表面接近中性;

c)加5.2.4.2d)中的无水乙醇10 mL继续抽滤,去除滤膜内水分;

d)取出滤膜,在5.2.1.6中的电热板上烘干;

e)按7.5.2进行硅藻检验。

A.2.1.2空气监测样品的检验

见 7.5。

A.2.1.3实验用水监测样品的检验

方法与A.2.1.1相同。

A.2.2硅藻检验室控制样品的检验

A.2.2.1实验耗材和试剂监测样品的检验

方法与A.2.1.1相同。

A.2.2.2空气监测样品的检验

见 7.5。

A.2.2.3实验用水监测样品的检验

方法与A.2.1.1相同。

A.2.2.4消解罐监测样品的检验

方法与A.2.1.1相同。

A.3控制样品制备和检验的周期

A.3.1检材提取室控制样品制备和检验的周期

每3个月不少于1次。

A.3.2硅藻检验室控制样品制备和检验的周期

消解罐使用前均应进行消解罐监测样品制备和检验,其他控制样品制备和检验每月不少于1次。

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