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短波紫外线照射血手印对其后PCR-STR DNA检验的影响研究

作者:毕思特科技 来源:毕思特科技 浏览数:109 发布时间:2018-11-12 10:34:51

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短波紫外线照射血手印对其后PCR-STR DNA检验的影响研究

摘要:目的 探讨短波紫外线照射血手印对其后荧光PCR—STR DNA检验的影响。方法 用短波紫外线(254nm)垂直照射载玻片上的血涂层,分不同血样量照射不同时间。提取血涂层用荧光PCR—STR复合扩增方法检测16个位点基因型。结果 随着照射时间的延长,各样品检出STR位点的个数呈下降趋势,且各位点等位基因的平均峰面积也呈下降趋势。其中,2μL血涂薄层单次照射后的检测结果:15s,30s,120s无影响;300s,1hour有不同程度影响;重复照射的检测结果:15s+15s,30s+30s无影响;120s+120s,300s+300s有不同程度影响。5μL血涂薄层与2μL血涂薄层相比,单次照射结果无明显差异,重复照射结果有明显差异。结论 在用短波紫外线照射处理血手印时,单次照射时间不超过120s,总照射时间不超过240s,以保证随后的PCR-STR DNA检验能达到所需位点数的最低要求。

关键词:短波紫外线;  血手印;  PCR-STR; DNA

目前,对于有些现场血手印多采用紫外反射照相显现技术提取指纹,由于紫外线的照射,尤其是短波紫外线的近距离照射往往对随后血手印的DNA检测结果有不同程度的影响[1],有些甚至因照射无法检出正确的基因型,影响证据的获取。

本文报道经短波紫外线垂直照射血涂薄层不同时间后,用ABI公司荧光PCR—STR试剂盒检测16个位点的基因分型结果,对不同照射时间、不同量血样的STR位点检出情况进行了试验性探讨研究。

1  材料

   新鲜抗凝人血5mL由中山市博爱医院血站提供。

2  方法

2、1 血手印的制备

现场血手印多为薄层血迹,本文采用新鲜抗凝血均匀涂于纯酒精清洗过的载玻片表面形成血薄层作血手印试验样本。取2μL和5μL混匀的新鲜抗凝血均匀涂布于载玻片表面形成20mm╳40mm血涂薄层,制备时,用另一载玻片边缘拖住血滴轻轻移动。血涂薄层紫外线照射处理前室温条件下保存于黑暗环境中48h。

2、2  短波紫外线照射

 用254nmAr+激光光源(SIRCHIE Krimesite SCOPE紫外勘查照相系统)垂直照射载玻片表面的血涂薄层,参数见表1。本文采用了不同量血样与不同照射时间两种条件。照射完毕后样品保存于黑暗通风环境下2-24h后进行下一步骤。每组均取一无照射样本作对照。

2、3  DNA提取

 用浸湿纯净水的干净单根棉线(5-8cm长)2-3根轻轻擦拭血薄层,直至将血迹提取完为止,所提血迹按Walsh 等[2]Chelex-100方法提取。其中2μL血薄层用100μL体系,5μL血薄层用200μL体系。

2、4  PCR反应

采用ABI 公司 AmpFLSTR®  IdentifilerTM PCR 扩增试剂盒分别扩增各样本,

10μL反应体系中含反应缓冲液4μL,引物混合物2μL,AmpTaq DNA聚合酶1U,ddH2O2.8μL, Chelex-100提取上清1μL。

PCR热循环参数:95°C11min热变性后,进入28个循环:94°C 1min,59°C 1min,72°C  1min,最后60°C保温60 min。

2、5  PCR产物检测

 PCR扩增产物在ABI公司310毛细管凝胶电泳遗传分析仪上检测,取1μL  PCR扩增产物与10μL上样混合液(甲酰胺:Liz500=10.5:0.5), 95°C变性3min后电泳。

2、6  基因分型与数据分析

 用ABI公司Genescan和 Genotyper 分析软件对各样本电泳结果进行分析,并将各等位基因片段的平均峰面积进行比较,制成柱形图。

3 结果与讨论

 2μL血涂薄层,单次照射15s,30s,120s后,15个STR位点和1个Amelogenin

位点均检出基因型;300s后,除D18S51、FGA两个位点未检出外,其余14个位点均检出;1hour后,仅有D18S51、D21S11、CSF1PO、D5S818、Amelogenin 5个位点检出基因型,其余11个位点未检出。与对照组相比,从15s到300s,随着照射时间延长,各位点等位基因平均峰面积呈下降趋势(另文发表)。1hour照射后,11个位点扩增失败。

2μL血涂薄层,重复照射15s+15s,30s+30s后,15个STR位点和1个

Amelogenin位点均检出基因型;120s+120s后,检出11个位点,其余D7S820、D2S1338、D18S51、D5S818、FGA、Amelogenin共 5个位点未检出;300s+300s后,仅有D2S11、D3S1358、D16S539、D19S433 共4个位点检出,其余12个位点均未检出,见表2。随着照射时间延长,各位点等位基因平均峰面积呈明显下降趋势(另文发表)。

5μL血涂薄层与2μL血涂薄层相比,单次照射15s,30s,120s,300s,1hour后,检出结果无明显差异。重复照射15s+15s,30s+30s后,检出结果无明显差异;120s+120s后,2μL血涂薄层检出10个位点,5μL血涂薄层检出15个位点;300s+300s后,2μL血涂薄层仅检出4个位点,5μL血涂薄层检出15个位点,见表2。随着照射时间延长,单次和重复照射后各位点等位基因片段平均峰面积也呈明显下降趋势(另文发表)。

利用紫外反射照相显现指印是目前痕迹检验中一种较常见且有效的无损检验方法,但由于在照射血手印的过程中,短波紫外线会对血迹中的DNA成分产生破坏,Julia Andersen [1]曾用Ar+激光、多波段绿光、Superlite和短波紫外线等五种不同光源照射血涂薄层后的DNA含量进行点杂交定量分析,发现短波紫外线(255nm)照射30s后血指印DNA大片段明显减少,甚至无法检测到DNA片段,而其它四种光源均无影响。其随后用vWA、TH01、F13A01、FES/FPS四个位点的复合扩增荧光检测,发现短波紫外照射30s内对扩增效果无影响,但超过30s则无法检出四个位点的基因型。

本研究采用ABI公司Identifiler 荧光标记引物试剂盒扩增各样本,并结合310毛细管凝胶电泳遗传分析仪进行电泳检测分析,同样是2μL血涂薄层,当照射时间为120s时,可完全检出16个位点;当照射时间为120s+120s时,仍可检出10个位点。另外,血量为5μL的血涂薄层,照射时间为300s时,可检出15个位点;照射时间为1hour时,仍可检出5个位点。这与ABI公司Identifiler 荧光标记引物试剂盒的检测灵敏度和310毛细管凝胶电泳遗传分析仪的检测灵敏度有很大提高有关。另外,本研究所制作的2μL血涂薄层面积为20mm╳40mm,而Julia Andersen报道用的血涂层是51mm╳76mm,这与血涂薄层的厚薄也可能有一定关系,但本研究所用血涂层厚度比较接近实际案件中遇到的真正血手印厚度。

本研究所用血手印是用新鲜血液在干净载玻片上形成血涂薄层代替,在实际案件中,因血手印可能比较陈旧,且有时会有各种环境污染,因而,所获得的结果可能会有一定的差异。提示在实际检案中,如需对血手印进行DNA检测时,应考虑血手印的厚薄以及新鲜程度,照射时间应控制在120s以内,尽量避免长时间照射,以保证后续PCR—STR 的DNA检验。

另外,要弄清短波紫外线照射血手印对其后PCR—STR检验影响的原因,下一步将对照射后的血手印提取的DNA进行含量以及片段损伤程度作进一步的定量及电泳分析,并同时针对案件中短波紫外线照射后的血手印进行分析,以评价其真正的影响程度。

 

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