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混合斑精虫DNA提取方法的探讨

作者:毕思特科技 来源:毕思特科技 浏览数:50 发布时间:2018-9-12 11:34:52

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混合斑精虫DNA提取方法的探讨

关键词  混合斑  Chelex-100  有机法

步骤方法

     1、接到案件检材后,首先肉眼观察可疑斑痕,剪取少量斑痕置于载玻片上加一滴蒸馏水浸泡,并放于保湿盒内10分钟,充分使斑痕浸泡出来,干燥,甲醇固定,用酸性品红亚甲兰染色镜检,并确定有精虫。

用两步法提取精虫DNA。分别剪取适量检材斑痕,用3mlTES浸泡10分钟,加300μlSDS及30μl PK,充分混匀后放入37℃水浴中孵浴90分钟,在第一步消化女性成分中,中间补加20μl PK,并每间隔15分钟混匀30秒。3500转离心10分钟,上清备用,沉渣再用蒸馏水洗涤3次,沉渣涂片镜检观察有精虫,用三种方法分别抽提DNA。

   方法1、有机法:

   取100μl沉渣于1.5ml管中,加400μl TES,50μl SDS及12μl PK和30μl DTT,置于37℃水浴中过夜,依次用等体积的饱和酚、等体积的1:1酚/氯仿,等体积的氯仿抽提,水相中加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并置于-20℃冰箱中20分钟,离心去上清,用滤纸小心吸去残留在管壁的水分,加30μl去离子水充分混匀后置于100℃水浴中30分钟,即可进行PCR扩增检测。

     方法2、Chelex-100法

取100μl沉渣置于1.5ml管中,加200μl Chelex-100,12μl PK及30μl的DTT,充分混匀后置于100℃水浴中30分钟,12000转离心后,取上清进行PCR扩增检测。

     方法3、用酚-氯仿抽提Chelex-100法提取DNA的上清液,操作同前。

2、精子DNA扩增:

     三种方法抽提的DNA与受害人、嫌疑人血样DNA一起同步扩增检测。PCR反应体系在20ul体系中进行。PCR缓冲液为50mmol/L KCL、10mmol/L Tris-Hcl、1.5mmol/L Mgcl、200mol/L dNTP,每组分别加0.5ulDNA,用本实验室自己合成的CSF1PO等14对引物进行检测,置于扩增仪中95℃4分钟后88℃条件下加入1u的DNA聚合酶,95℃15秒,60℃15秒,72℃45秒,循环14次,在90℃15秒,60℃15秒,72℃45秒循环16次,95℃5分钟后备检。

3、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳90分钟,AgNO3染色,碳酸钠显色。

结果

方法1、杂带多,主带不明显,个别位点仅扩增出女性成分。

方法2、杂带多,主带不清晰,多扩增出混合成分,影响判型。

方法3、主带清晰,杂带少,能准确判型。

讨论

有机法提取DNA过程中,利用DNA只溶于水,而难溶于有机溶剂这一特性,用有机溶剂进行萃取,清除检材中脂类、色素、染料等,并使蛋白质(酶类)变性,使DNA得以浓缩纯化,但其有不能有效地祛除金属离子对扩增的影响及步骤繁琐,污染机会多,DNA损失等缺点;5%的Chelex-100法,是利用Chelex-100具有较强的金属离子亲和力,能彻底地螯和金属离子,清除金属离子对扩增的抑制,并防止DNA的降解,而且方法简便快捷,并在100℃煮沸30分钟的条件下使精虫细胞膜得以破裂,精虫DNA得到有效释放,其缺点是检材中的高浓度金属离子、色素、染料、脂类、蛋白质等成分不能清除,DNA未得到浓缩。

作者在对强奸案件的检验中,特别是对一些较脏、带颜色的内裤、床单,混有女性处女膜破裂血样及月经血的检材,以及卫生巾、草纸等对扩增影响较大的检材采用三种方法进行DNA抽提,用单纯的有机法时,可能因为女性成分太多,而精虫DNA量较小,并由于有精液中高浓度的Zn¬¬2+的影响,使靶DNA不能扩增,故部分位点只扩增出女性DNA谱带;用Chelex-100法抽提DNA,由于螯和了金属离子,并在100℃煮沸过程中使精虫细胞膜破裂,靶DNA得到有效释放,同时Chelex-100与DNA竞争结合抑制物,从而消除抑制物对PCR反应抑制的作用。但由于DNA提取体系过大,DNA未得到有效浓缩,在扩增中女性成分也得到了扩增,故扩增谱带显示混合成分;方法3中,很好地利用了Chelex-100法及有机法抽提DNA的优点,得到了高浓度,污染物小的靶DNA,扩增出需要的精虫DNA谱带,很好地解决了女性成分较多、较脏、精虫量较少的强奸案检材的检验。

在强奸案的检验中,特别针对混有大量女性成分(阴道上皮细胞、子宫内膜细胞及血液)的检材,都采用Chelex-100联合有机法进行靶DNA的提取,都有效地减少了女性成分的干扰,取得很好的效果。在案件检验中,作者还采用在混合斑第一步消化时中途补加PK,不时混匀等方法,使女性成分在第一步时就得到很好的消化。并在提取出DNA经无水乙醇沉淀后,用滤纸吸干管壁的乙醇,根据估计DNA量加适量去离子水溶解,并置于100℃水浴中孵浴30分钟,即可进行PCR扩增检测,从而缩短了DNA的溶解时间,并能在高温下起到灭菌作用,消除细菌等对扩增的影响。

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