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PCR-STR技术在混合斑鉴定中的运用

作者:毕思特科技 来源:毕思特科技 浏览数:156 发布时间:2018-9-12 11:33:21

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PCR-STR技术在混合斑鉴定中的运用

摘要 应用STR基因座同步PCR扩增、聚丙硒酰胺凝胶垂直板电泳分离和常规银染方法,进行混合斑个人识别鉴定。在检验中发现一例采用酚-氯仿方法不能提取出男性成分,而用Chelex法提取检材得到很好的精子DNA。同时在检验中运用自己合成基因座与标准试剂盒联合运用排查大量嫌疑人。

混合斑的个人识别在法医学物证检验中是最常见的检测项目,混合斑的检验可以根据案情需要来确定,常规是对其精子成分进行分离并与嫌疑人鉴别比对,但也可对其中的女性成分进行鉴别。自Gill等[1]1985年建立混合斑精子的提取方法后,应用PCR进行混合斑的个人识别已经取得突破性进展。但在实际检案中,由于检材的千差万别,操作过程的复杂化等,在检验中的效果就出现差异。本文就一特殊案例的检验技术进行讨论。

1 材料与方法

1.1 材料

一起杀人案中,死者徐××(女、58岁)在自家田里被害,下身衣裤有拉扯破烂痕迹,尸检中阴道口干燥,提取①、死者阴道分泌物;②死者血样;③、死者丈夫段××血样;④晋XX等19名嫌疑人血液(痕)。分泌物量较少。初镜检一个视野下有5-10个精虫,女性成分量较多。

1.2  DNA提取

采用两种方法提取DNA,比较扩增效果。①、酚-氯仿法提取DNA;②、Chelex-100提取DNA(2)。

PCR扩增

1.3.1 基因座

①、 采用本实验室自己合成的引物进行初检。用CSF1PO、TPOX、TH01、D13S317、D5S818、D7S820、性别等基因座进行初检排除。

②、 采用我省推广使用的人类STR六个双基因座复合扩增银染试剂盒(珠海黑马公司)进行标准化。A、PLA2A+CSF1PO;B、D3S1358+D13S317;C、D5S818+D19S400;D、VWA+D12S391;E、D1S1656+FGA;F、GABRB15+D19S253。

1.3.2  PCR反应体系

PCR反应体系为20μl,含1×反应缓冲液(10mmol/LTris-Hcl,PH9.0,50mmol/Lkcl,1.5mmol/Lmgcl2,0.01mg/ml白明胶),0.5uTaq酶,模板DNA0.5μl(约5ng)。0.4μmol/L引物,dNTP200μmol/L。用PE-9600型扩增仪,循环参数:95℃ 2min后加入0.5uTaq酶(华美公司), 95℃ 30s,60℃30s,72℃ 45s,循环10次,再95℃ 30s,60℃30s,72℃ 45s,循环20次,95℃ 5min变性后备检。


1.3.3 电泳分离及银染显带

实验用6%聚丙稀酰胺凝胶电泳,凝胶大小为40cmx24cmx0.6cm,以试剂盒各基因座的等位标准物为Marker,1400V(40W)电泳90min。银染为10%乙醇,5%冰乙酸固定10min ,双蒸水洗30sec,1%硝酸银染色10min,双蒸水洗30sec,1.5%无水碳酸钠、0.1%甲醛显色至出结果,用固定液停显。

1.3.4 概率计算:按贾静涛介绍的方法(3)。

2 结果

2.1 阴道分泌物内精虫的两种提取方法比较:均采用两步法提取,其中酚-氯仿提取的混合斑DNA在扩增时未扩出需要的男性谱带,多个位点均只检出女性成分;而用Chelex法提取的DNA扩增出交好的效果,其中部分位点同时扩增出女性成分。

2.2 经采用自己合成的基因座排除嫌疑人18名,唯有晋付德不能排除,采用上述所述试剂盒进行扩增,认定了嫌疑人晋付德,偶合概率为1.2808×10-19(12个基因座)。

讨论

混合斑个人识别是法医物证检验中常见的检材,PCR扩增技术在运用于法医学检验后,使得精斑、混合斑的个体识别问题得以解决,但由于案件检材条件的多样性、复杂性,带来工作中的许多问题,作者认为在精斑,特别是混合斑的检验中,精虫DNA的提取是检案成功的关键。

在进行DNA提取时,常规的镜检精虫试验必须进行,观察检材精虫密度,同时观察女性成分的比例,当女性成分较多时,在进行两步法消化时,加入适量PK后,置37度水浴中过夜,期间振动2-5次,并补加PK适量,洗涤3-5次,尽量减少女性成分的干扰。作者采用两种方法进行提取DNA,经过扩增检测,Chelex-100法提取DNA的扩增效果明显好于传统酚-氯仿法。这与余纯应等(4)的研究不符,同时在其他强奸案的检测中,未出现此情况,可能是由于提取的检材混合斑中女性成分太多,未能彻底清除女性成分,导致女性成分残留太多,有机法提取的DNA女性成分比例较大得以优先扩增,而采用Chelex-100法时,由于经过30分钟的煮沸,精虫DNA 得以有效释放,精虫DNA的比例较大的原因。

在检验中,作者先利用本实验室合成的引物做初步扩增检测,排除了多数嫌疑人遗留精虫的可能性,最后对在多个基因座都不能排除可能性的嫌疑人晋付德,利用试剂盒检测,并计算偶合概率(PM),最终认定死者阴道擦拭物内精虫系嫌疑人晋付德所留。利用自己合成引物结合试剂盒进行联合检验,最大限度地节约了资金。

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