荧光标记D10S676基因座的遗传学多态性研究

荧光标记D10S676基因座的遗传学多态性研究

 [关键词] STR、PCR、荧光标记D10S676、

    短串联重复序列（Short  tandem  repeats,STR）是由2-6bp重复单位构成的微卫星DNA。STR基因座在人类基因组中含量丰富，其多态片段长度范围大多在100-300bp之间。由于STR位点多态性好，扩增成功率高，判型准确而适用于DNA高度降解检材，因而在法医学领域中得以广泛应用。随着STR位点扩增越来越多，该技术已由过去单一的排除发展到现在的同一认定，在法医物证学个人识别及亲权鉴定方面发挥越来越大的作用。STR分析从单个位点扩增到多位点复合扩增，从银染技术到多色荧光检测技术，日趋自动化，具有较强的实用性。目前多色荧光检测STR技术已在法医DNA检验中逐渐普及。本文即采用多色荧光检测技术对FAM蓝色荧光标记的D10S676基因座的遗传多态性进行初步研究，为进一步研制多基因座荧光标记复合扩增试剂打下基础。

    D10S676是位于人类第10号常染色体上的四核苷酸重复STR位点，其重复单元为AGAT。在实验中运用荧光标记-毛细管电泳法，可以准确检测等位基因片段，其误差仅在0.5bp以内[1]，目前国内尚未有关此位点遗传多态性研究的报道。本文应用荧光标记的引物进行D10S676基因座的PCR扩增和检验，获取了D10S676基因座情况。

1 材料与方法

1．1检材及提取

    103份无关个体的EDTA抗凝血由人民医院血库提供，检材的提取参照文献进行。

1．2试剂

    D10S676位点引物序列为：5’-GAGAACAGACCCCCAAATCT-3’； 5’-ATTTCAGTTTTACTATGTGCATGC-3’，由上海生工生物工程公司合成；Taq酶购于华美公司。

1．3 STR  分型

    PCR反应体系为20μl，含1×反应缓冲液（10mmol/LTris-Hcl,PH9.0,50mmol/Lkcl,1.5mmol/Lmgcl2,0.01mg/ml白明胶），0.5uTaq酶，模板DNA0.5μl(约5ng)。0.4μmol/L引物,dNTP200μmol/L。用PE-9600型扩增仪，循环参数：95℃ 2min后加入0.5uTaq酶（华美公司）， 95℃ 30s,60℃30s,72℃ 45s，循环10次，再95℃ 30s,60℃30s,72℃ 45s，循环20次，95℃ 5min变性后备检。扩增产物采用毛细管电泳分离，ABI3100遗传分析仪分析。

1．4统计学分析

    记录每个样的基因型，计算基因频率，对基因型分别作χ2检验。按相关公式计算杂合度（H），个体识别率（Dp），多态性信息含量（PIC）[3]及非父排除率（PE）[4]。

2 结果

2.1等位基因及基因型分布

103名汉族无关个体中检出7个等位基因及16种基因型。其等位基因及基因频率分布见表1。

3 讨论

    目前，STR基因座已被广泛应用于法医学领域，经对FAM蓝色荧光标记D10S676基因座PCR扩增产物，并采用毛细管电泳及ABI PrismTM3100遗传分析仪，获得良好的分离效果，判型准确，最终确定D10S676基因座共有7个等位基因，其多态性片段长度范围为177-201bp。按分子量大小将D10S676基因座的7个等位基因分别命名为11、12、13、14、15、16、17。对该基因座所有分型作卡方检验，其基因性的观察值与期望值吻合良好，符合Hard  Weinberg平衡。D10S676基因座等位基因及其基因型分布频率调查结果表明，该基因座是一个理想的高多态性STR标记系统，在法医学亲权鉴定及个体识别案件中具有较高的实用价值。

本研究首次应用国产荧光染料标记引物进行多态性研究。试验中采用多色荧光检测技术，避免了传统的银染法灵敏度低、检测率及分辨率不高的缺点，提高了检测灵敏度和成功率，提高了DNA检验的自动化程度。由于本实验室还未购置测序仪，还不能进行测序分型技术的应用，但通过本研究表明，应用对国产荧光染料标记引物扩增产物染色，也能够较好地对扩增产物进行检测。并且由于应用国产引物，为国家节约了外汇储备。也为进一步研制荧光标记基因座复合扩增检测试剂打下基础。