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硅珠法在纯化污染检材中的应用

作者:毕思特科技 来源:毕思特科技 浏览数:69 发布时间:2018-7-12 9:23:17

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硅珠法在纯化污染检材中的应用

污染检材的处理是法医DNA检验经常遇到的难题,如何有效去除检材中PCR扩增的抑制成份,并获得纯净的DNA样本是法医DNA检验能否成功的关键。尤其对于已经采用常规方法,如Chelex法进行DNA提取检验失败后,剩余DNA样本的再纯化方法更是困扰每一个DNA检验人员的难点。现在采用的有机溶剂纯化方法,虽然能够获得高质量DNA,但操作复杂,易受到人为因素影响;进口的纯化试剂盒、纯化柱等产品造价昂贵,不能广泛应用。本文通过对硅珠法进行改进,提高硅珠-DNA吸附后的洗涤强度,直接纯化Chelex法处理后的DNA提取液,获得了满意的结果。

1. 材料与方法

1.1  样本

取自本实验室日常积累的刑事案件检材。

1.2  主要仪器设备及试剂

3100型基因分析仪;AmpFlSTR IdentifilerTM 复合扩增试剂盒;POP-4胶;Chelex—100;硅珠;硫氰酸胍

1.3  试剂的配制

硅珠悬液、吸附液、漂洗液按照文献[1]配制;漂洗液I:50 mmol/l Tris•HCl (pH=8.0), 5 mmol/l EDTA, 100 mmol/l NaCl,50%乙醇。

1.4  实验方法

1.4.1  DNA提取

血斑DNA提取:用Chelex法处理血斑检材提取DNA[2]。

混合斑DNA提取:参照文献[3、4]的方法,经过套管离心法去除女性成份,Chelex法得到精子的DNA溶液。

DNA的纯化:1、取Chelex法处理后的DNA上清溶液,加入3倍体积吸附液,95℃孵育5 min;加入20μl硅珠悬液,室温放置10 min;漂洗液洗涤一次,漂洗液I洗涤两次,室温开口放置10 min;加入适量去离子水旋涡震荡30 秒,56 ℃温育5 min,12000 rpm离心2 min,取上清待用。2、对于Chelex法不能有效溶下血斑的检材,同时将检材和上清加入3倍体积吸附液,其余步骤同上。

1.4.2  PCR扩增与扩增产物的分离检测 

   按照参考文献方法进行[5]。在ABI3100基因分析仪上,用POP-4液态胶进行毛细管电泳,Collection收集软件收集电泳信息,GeneScan Analysis3.7和Genotype3.7软件进行检测分型。

2  结果与讨论

Boom等[6]首先报道了硅珠法提取DNA,其基本操作为:1、利用硫氰酸胍等强烈蛋白变性剂,破坏细胞膜及核膜蛋白,释放DNA,并使核酸酶失活;2、加入硅珠特异性吸附DNA;3、通过洗涤液酸碱度、离子强度的控制,去除PCR抑制剂。4、56 ℃解离,将DNA重新溶出。国内已经将硅珠法成功用于血斑[1]、混合斑[1]、骨骼[7]、指纹[8]DNA的提取,解决了许多法医DNA中的难点。本研究利用硫氰酸胍强烈变性蛋白的特性,将通过去离子水浸泡、洗涤、Chelex—100螯合、煮沸等过程仍不能去除PCR扩增抑制成份、使DNA有效溶出的生物样本,直接进行重新处理,避免了检材的浪费。并在文献[1,5、6、7]的基础上增强洗涤液的离子强度,因此能够更加有效地去除抑制成份,提高硅珠特异性吸附、纯化DNA的效能。在样本的前期处理上省去TES(SDS)煮沸步骤[1],节省了时间。本方法已经应用在实际案件检验,并获得了满意的结果。

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